光学显微镜的使用及示教片的观察

        一、实验目的 1、学习和掌握油杯的使用原理和方法。 2、复习普通台式显微镜各部分的结构、功能和使用方法。 2、显微镜的基本结构和油镜的工作原理。现代普通光学显微镜采用目镜和物镜两种透镜系统进行放大成像，因此常被称为复合显微镜。它们由两部分组成：机械装置和光学系统。在显微镜的光学系统中，物镜的性能关键，它直接影响着显微镜的分辨率。在普通光学显微镜常用的几种物镜中，油镜的放大倍数，是微生物研究中最重要的。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需要在载玻片和镜头之间加一滴镜头油。这主要是以下两个原因： 1. 增加照明油透镜的亮度，放大倍数可以达到100 Χ，这么大的放大倍数的镜头焦距短，直径小，但所需的光强是的。载有标本的载玻片发出的光，由于介质密度不同（从载玻片进入空气，再进入透镜），部分光线会因折射或全反射而无法进入透镜，导致使用油镜由于光线较少，物体的图像不清晰。因此，为了不损失通过的光线，在使用油镜时，必须在油镜和玻璃（通常是雪松油，其折射率为指数为 n = 1.52）。 2、提高显微镜的分辨率 显微镜的分辨率或分辨力是指显微镜分辨两点之间最小距离的能力。从物理角度来看，光学显微镜的分辨率受光干涉现象和所用物镜性能的限制。分辨率D可以表示为：D=λ/2N.A，其中λ=光的波长； NA=物镜数值孔径值。光学显微镜的光源不能超过可见光的波长范围（0.4-0.7μm），数值孔径值取决于物镜的透镜角度和载玻片与透镜之间介质的折射率，可表示为： NA=n × 在sin α的公式中，α为光入射角的一半。这取决于物镜的直径和焦距。一般来说，实际应用中只能达到120 O，n为介质的折射率。由于雪松油的折射率 (1.52）高于空气和水的折射率（分别为1.0和1.33），所以以雪松油为介质的镜片与玻璃之间的油镜所能达到的数值孔径值（NA一般为1.2-1.4）为更高 适用于低倍镜和高倍镜（NA低于1.0）等干式镜片。如果以可见光的平均波长0.55μm计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍透镜只能分辨距离不小于0.4μm的物体，而油性透镜的分辨率可以达到0.2μm左右.三、实验设备 1、菌株：枯草芽孢杆菌染色玻片标本。青霉菌（Penicillium sp.）水封等（教师可根据具体情况选择菌种）。 2、溶液或试剂：雪松油、乙醇：yi醚混合物 3、仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等 4、操作步骤 1、观察前的准备 （1）显微镜的放置：将显微镜放在平板实验台，镜头卡口距实验台边缘约3-4cm。显微镜检查时姿势应正确。用一只手握住显微镜的臂，另一只手握住底座，以保持显微镜直立和稳定。不要用一只手搬运；无论您使用单目显微镜还是双目显微镜，都应同时睁开双眼进行观察，以减少眼睛疲劳，同时也便于在绘图或记录时进行观察。 (2)光源调节：安装在镜架上的光源灯可以通过电压调节，以获得合适的照明亮度，当使用反射器收集自然光或光作为照明光源时，应根据光源的强度和物镜的放大倍数采用凹面或凸面反射镜并调整其角度，使视场内光线均匀，亮度适宜。 (3)根据用户的个人情况调整双目显微镜的目镜。双目显微镜的目镜间距可以适当调节，左目镜一般配有屈光度调节环，可以适应不同的眼距或视力。不同观察者的差异。 (4)聚光器数值孔径的调节：调节聚光器的光圈孔径值，使其与物镜的数值孔径值一致或略低。有些显微镜的聚光镜只标注了数值孔径值，并没有具体的孔径刻度。使用本显微镜时，可以在样品聚焦后取下目镜，在从镜筒观察视野的同时放大光圈。调整光圈边缘与物镜黑圈相切或略小于其边缘。.由于每个物镜的数值孔径不同，每次更换物镜时都要进行这种调整。聚光镜的数值孔径值确定后，如果需要改变光强，可以通过升降聚光镜或改变光源的亮度来实现。原则上不应通过虹彩光圈进行调整。当然，虹彩光圈的使用原理、聚光镜的高度和照明光源的强度都不是固定的。只要能获得良好的观察效果，有时可以根据不同的具体情况灵活使用，不一定是固定的。 2、对于显微观察，在目镜不变的情况下，不同倍率物镜所能达到的分辨率和放大倍数是不同的。一般情况下，特别是初学者，在进行显微观察时，应遵循从低倍到高倍再到油镜的观察程序，因为低倍物镜的视场比较大，容易找到目标和确定检查位置。 (1)低倍观察金黄色葡萄球菌染色标本。将载玻片放在载物台上，用样品夹夹住，移动推进器，使观察对象直接位于物镜下方。降低 10X 物镜使其靠近样品。用粗调器慢慢抬起镜筒，使标本初步聚焦在视野内，然后用微调器将图像调得清晰。缓慢移动载玻片通过载玻片夹推杆，仔细观察标本的各个部位，找到合适的目标，仔细观察并记录观察结果。任何时候用粗调器对图像进行调焦时，要养成从侧面仔细调整靠近标本的物镜*的习惯，然后用目镜观察，慢慢调整远离标本的物镜准直，以免暂时误操作。损坏镜头和载玻片。 (2) 用高倍镜观察。在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转盘，将高倍镜移至工作位置。适当调整聚光器孔径和视野亮度后，微调微调器使物像清晰，用螺旋桨移动试样仔细观察并记录观察结果。一般情况下，当物像已经在物镜中清晰聚焦后，物镜转至工作位置观察时，物像基本保持在焦点上。这种现象称为物镜共焦（parfocal）。利用这种共焦现象，可以保证在使用高倍率或高倍率短工作距离的油镜时，仅用微调器就可以清晰聚焦物像，避免使用粗调器的可能.误操作损坏镜头或载玻片。 (3)油镜观察高倍镜或低倍镜找到要观察的样品区域后，用粗调器将镜筒抬高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区加一滴雪松油，从侧面看，用粗调器小心地降低镜筒，使油镜浸入镜油中，几乎与镜筒接触。标本。将聚光镜升至位置并打开全孔径。如果使用的冷凝器的数值孔径超过 1.0，请在冷凝器和载玻片之间加入一滴雪松油，以确保其效率。调整照明，使视野的亮度合适。使用粗调器缓慢抬起镜筒，直到视野中出现物体图像，然后使用微调器使其清晰对焦。有时按上述操作找不到目标物体，可能是油镜没有降到位，或者油镜升得太快，使眼睛无法捕捉到经过物体的图像。在这种情况下，您应该重新操作。此外，要特别注意不要在降低镜头时用力过大或在调整焦距时错误地将粗调器向相反方向转动而损坏镜头和载玻片。三、显微镜使用后的处理 (1) 抬起镜筒，取下载玻片。 (2)用擦镜纸擦去镜头上的擦镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（雪松油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油，最后用干净的镜头清洁纸 去除残留的二甲苯。 (3)用镜头清洁纸清洁其他物镜和目镜；用丝布清洁显微镜的金属部分。 (4)还原各部分，反射镜垂直于镜座，将物镜转成“八"字形，然后向下旋转。同时，降低聚光镜以避免物镜和聚光镜碰撞的风险。五、实验报告 1、画出你在低倍、高倍和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌和青霉菌的形态，包括三种情况下的视野品种。还要注明物镜放大倍数和总放大倍数。六、问题 1、用油镜观察时应注意哪些问题？载玻片和镜片之间加什么油？它扮演什么角色？ 2、测试单比较了低倍镜、高倍镜和油镜的区别。为什么在使用高倍镜和油镜时要特别注意避免粗调器误操作？ 3、物镜的共焦现象是什么？它在显微观察中有什么意义？ 4、影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 5.根据你的实验经验，谈谈如何根据观察微生物的大小选择不同的物镜进行有效观察。